Por: Claudia Ipucha
En 2012, un equipo encabezado por Martin Jinek, Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier publicó en Science un experimento que parecía, en principio, bastante específico: reconstruir en el laboratorio un sistema que ciertas bacterias utilizan para reconocer y cortar ADN extraño.
El sistema estaba formado por una proteína, Cas9, y dos moléculas de ARN. Una de ellas aportaba la secuencia capaz de reconocer el ADN blanco; la otra participaba en la formación del complejo necesario para que Cas9 actuara.
Los investigadores demostraron que, al modificar la secuencia del ARN guía, podían dirigir a Cas9 hacia distintas secuencias de ADN. También comprobaron que los dos ARN naturales podían fusionarse en una única molécula diseñada en el laboratorio, el single-guide RNA o sgRNA. Con ese ARN guía artificial, Cas9 podía programarse para reconocer y cortar secuencias elegidas de ADN in vitro.
La edición genética acababa de incorporar una herramienta basada en una nucleasa guiada por ARN.
Antes de CRISPR, el ARN
Jennifer Doudna llevaba muchos años estudiando ARN cuando comenzó a trabajar con sistemas CRISPR.
Su trayectoria científica se había desarrollado alrededor de una pregunta diferente: cómo la estructura tridimensional de las moléculas de ARN determina lo que pueden hacer.
Durante la década de 1990 participó en estudios estructurales de ribozimas, moléculas de ARN capaces de realizar funciones catalíticas. En 1996, Doudna y sus colaboradores publicaron la estructura cristalográfica del dominio P4–P6 de una ribozima del intrón de grupo I de Tetrahymena thermophila. Ese trabajo contribuyó a comprender cómo una molécula grande de ARN podía plegarse y establecer interacciones tridimensionales específicas.
Esa experiencia en estructura, función y reconocimiento molecular del ARN resultaría especialmente relevante cuando comenzó a trabajar sobre CRISPR.
Un sistema de defensa bacteriano
CRISPR-Cas surgió mucho antes de convertirse en una herramienta de laboratorio.
Estos sistemas forman parte de mecanismos de inmunidad adaptativa presentes en bacterias y arqueas. Fragmentos de material genético procedente de elementos invasores pueden incorporarse a regiones CRISPR del genoma bacteriano. A partir de ellas se producen ARN que participan posteriormente en el reconocimiento de secuencias complementarias, mientras distintas proteínas Cas intervienen en las etapas de la respuesta.
Dentro de esa historia, el trabajo de Emmanuelle Charpentier aportó una pieza fundamental.
Su grupo estudiaba el sistema CRISPR de Streptococcus pyogenes. En 2011 identificó una pequeña molécula de ARN denominada tracrRNA, que se apareaba con el precursor del crRNA y participaba en su maduración mediante RNasa III. El estudio mostró además que estos componentes eran necesarios para la defensa frente a ADN invasor.
Ese hallazgo condujo a la colaboración entre Charpentier y Doudna.
En ese momento podían plantearse dos preguntas diferentes. Una buscaba comprender cómo funcionaba CRISPR-Cas9 dentro de una bacteria. La otra exploraba la posibilidad de reconstruir ese mecanismo y dirigirlo hacia una secuencia elegida.
El trabajo publicado en 2012 avanzó sobre esta segunda pregunta.
Convertir un mecanismo natural en un sistema programable
Cas9 es una endonucleasa guiada por ARN.
En el sistema estudiado, la secuencia del crRNA establece complementariedad con el ADN diana, mientras Cas9 produce una rotura de ambas cadenas del ADN. El reconocimiento depende también de una pequeña secuencia adyacente denominada PAM.
Jinek y colaboradores demostraron experimentalmente que la secuencia guía podía modificarse para dirigir el corte hacia blancos diferentes. Después simplificaron el sistema fusionando crRNA y tracrRNA en una única molécula diseñada artificialmente que conservaba la capacidad de dirigir Cas9.
La especificidad del sistema podía modificarse diseñando la secuencia correspondiente del ARN guía. Esa característica facilitó enormemente su adaptación como herramienta experimental.
Del tubo de ensayo al genoma de una célula
El artículo de 2012 demostró el corte programable de ADN en un sistema bioquímico in vitro.
A comienzos de 2013, distintos grupos demostraron que Cas9 guiada por ARN podía dirigirse hacia secuencias específicas de genomas de células humanas y de otros mamíferos. Una rotura dirigida del ADN podía entonces ser procesada por los propios mecanismos celulares de reparación, permitiendo generar modificaciones en loci seleccionados. Entre los trabajos publicados ese año se encuentran los de Le Cong y colaboradores y Prashant Mali y colaboradores en Science.
CRISPR-Cas9 pasó así de un mecanismo bacteriano reconstruido bioquímicamente a una plataforma de ingeniería genómica.
Su utilidad surgía de una combinación especialmente práctica: el reconocimiento de la secuencia estaba determinado principalmente por un ARN que podía rediseñarse, mientras Cas9 funcionaba como componente efector.
Con el tiempo aparecieron variantes de Cas9, otras nucleasas CRISPR y numerosos sistemas derivados. La plataforma se extendió hacia aplicaciones que incluyen modificación de secuencias, regulación de la expresión génica y otras formas de manipulación dirigida de regiones genómicas.
Una tecnología que también planteó límites
La posibilidad de modificar secuencias genómicas humanas introdujo preguntas que excedían el funcionamiento molecular de la herramienta.
En 2015, Doudna participó junto con David Baltimore, Paul Berg y otros investigadores en una publicación de Science que proponía ampliar la discusión científica y social sobre la ingeniería genómica, con especial atención a las modificaciones heredables de la línea germinal humana.
La discusión adquirió todavía mayor relevancia a medida que CRISPR comenzó a incorporarse a investigaciones biomédicas y ensayos orientados hacia aplicaciones terapéuticas.
Doudna participó activamente en esos debates, una faceta de su trayectoria científica que quedó estrechamente vinculada con el desarrollo de la propia tecnología.
Doudna dentro de una historia colectiva
La historia de CRISPR-Cas9 permite observar con bastante claridad cómo se construye una tecnología científica.
Las secuencias CRISPR habían sido descriptas años antes. Diferentes grupos establecieron progresivamente su relación con la inmunidad bacteriana. Otros investigadores demostraron que el sistema podía adquirir fragmentos procedentes de virus y utilizarlos posteriormente para reconocer material genético invasor.
El grupo de Charpentier identificó el tracrRNA y explicó su participación en la maduración del crRNA. Los equipos de Charpentier y Doudna reconstruyeron posteriormente el sistema de Cas9 y demostraron que podía programarse mediante ARN. Meses más tarde, otros laboratorios consiguieron utilizarlo para modificar genomas de células eucariotas.
El aporte de Jennifer Doudna ocupa un lugar preciso dentro de esa secuencia. Su experiencia en bioquímica y estructura del ARN contribuyó a convertir el conocimiento de un mecanismo bacteriano en una herramienta molecular programable.
En 2020, Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Química por el desarrollo de un método para la edición del genoma.
El recorrido que llevó hasta allí comenzó mucho antes del Nobel y reunió aportes de numerosos grupos de investigación: desde el estudio de la inmunidad bacteriana hasta la caracterización molecular de Cas9 y su posterior adaptación como herramienta.
En el trabajo de Doudna, ese recorrido conecta dos campos que habían ocupado buena parte de su carrera: comprender cómo funciona el ARN y utilizar ese conocimiento para controlar una reacción molecular específica.
Bibliografía
